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配子發生機制研究不僅是魚類生殖生物學研究的重要命題，而且是突破魚類借腹生殖等精準育種技術的科學需求。在魚類雄性性腺中，精子發生過程包含有生殖細胞的有絲分裂和減數分裂，產生從精原細胞到精母細胞再到精子細胞的眾多生精細胞（spermatogenic cells）亞型。對這些不同亞型的生精細胞進行精確鑒定，是魚類精子發生研究的基礎。目前對魚類生精細胞亞型的鑒定通常基于細胞及細胞核的形態學特征，其準確性和可靠性強烈依賴于研究者的經驗，很大程度上缺乏細胞生物學證據。理論上，利用生精細胞發育和分化過程中特征性蛋白的表達譜式，將能夠更加客觀和準確地鑒定不同亞型的生精細胞。然而，目前可用于魚類生精細胞鑒定的工具抗體十分缺乏，加之現有的免疫熒光技術無法適應大數據驅動的高通量研究新范式，嚴重阻礙了這一研究領域的發展。
中國科院水生生物研究所孫永華團隊針對上述難題，系統開發了特異性識別魚類配子發生相關的Ddx4（Vasa）和Piwil1蛋白，以及減數分裂和有絲分裂相關的Sycp3和Pcna蛋白的一套多克隆抗體，并在此基礎上建立了一個適應于高通量操作的免疫熒光技術流程（圖1）。利用這些抗體和建立的高通量免疫熒光技術，該團隊精細鑒定了斑馬魚、稀有鮈鯽、鯉魚、團頭魴、草魚、黃鱔等多種魚類的生精細胞亞型。
圖1 抗體制備和優化的免疫熒光技術流程，及抗體的蛋白質免疫印跡檢測
該團隊以斑馬魚精巢為研究對象，通過Ddx4、Pcna、Sycp3及細胞核的四色免疫熒光共染實驗，實現一次性精細鑒定了13種不同亞型的生精細胞。它們分別是靜息態單細胞A型精原細胞quiescent SPG-A(1-cell)、有絲分裂態單細胞A型精原細胞mitotic SPG-A(1-cell)、精小囊中含有2、4或8個細胞的A型精原細胞SPG-A(2,4,8-cell)、精小囊中含有16或32個細胞的B型精原細胞SPG-B(16,32-cell)、精小囊中含有64、128或256個細胞的B型精原細胞SPG-B(64,128,256-cell)、細線期初級精母細胞SPC-I(L)、偶線早期初級精母細胞SPC-I(EZ)，偶線中晚期初級精母細胞SPC-I(MZ/LZ)、粗線期初級精母細胞SPC-I(P)、次級精母細胞SPC-II、精子細胞SPD和精子SPZ（圖2A-J）。最后，他們提出了基于細胞形態學和特征蛋白表達譜式來鑒定魚類生精細胞13個亞型的新標準（圖2K）。
值得一提的是，在斑馬魚精子發生領域，前人學者僅根據形態特征，就武斷地將SPG-A(1-cell)稱作未分化的A型精原細胞（SPG-Aund），而將SGP-A(2,4,8-cell)統稱為分化的A型精原細胞（SPG-Adiff），導致這一概念在領域內被廣為傳播。孫永華團隊通過上述生精細胞亞型鑒定的新標準，更正了這一領域長久以來的錯誤定義，提出了更為客觀的命名標準，為深入開展魚類精原干細胞自我更新和分化研究提供了更加科學的定義和更為強大的工具。
圖2 利用Ddx4、Pcna、Sycp3及細胞核的四色免疫熒光技術對不同亞型生精細胞進行精確鑒定（A-J）），提出魚類生精細胞亞型鑒定的新標準
近日，相關研究成果在線發表于國際學術期刊Frontiers in Endocrinology（https://doi.org/10.3389/fendo.2023.1044318）。水生所孫永華研究員為通訊作者，青年研究員葉鼎和碩士研究生劉濤為共同第一作者，水生所朱作言院士、胡煒研究員、汪亞平研究員等參與合作研究。該項研究獲得國家自然科學基金等資助，文中產生的各類抗體資源已保藏至國家水生生物種質資源庫國家斑馬魚資源中心。